Análise de tamanho de partículas
Espalhamento de Luz – DLS
A técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz – DLS (Dynamic Light Scattering) é a técnica por excelência para caracterizar o tamanho de nanopartículas.
Para amostras adequadas e corretamente preparadas, oferece resultados precisos em um minuto ou menos.
Vantagens:
Desvantagens:
Baseada nas equações de Mie e Rayleigh, calcula uma estatística de distribuição de tamanho de uma população de partículas. Não mede partículas individuais.
Ideal para látexes, lipossomas, nanoemulsões, proteínas e outros materiais onde a distribuição de tamanho é bastante estreita.
Faixa ideal de utilização: 5 nm a 1 µm. Sistemas com laser de maior potência e/ou detetores APD podem chegar abaixo de 1 nm.
As partículas podem estar dispersas em qualquer líquido transparente e pouco viscoso.
Alerta! Algumas especificações publicadas (por todos os fabricantes) não informam claramente certos limites intrínsecos à técnica DLS:
Anos atrás, o marketing de um fabricante teve uma ideia genial: (ab)usar as especificações para bloquear os concorrentes em licitações. Funcionou! Tão bem que todos os concorrentes tiveram que copiar.
É certamente possível detectar partículas de 10 µm em suspensão.
Se o que você quer é detectar a presença (ou ausência) de partículas maiores/ agregados, DLS é excelente, ele detecta quantidades mínimas dessas partículas maiores.
Mas, caracterizar essas partículas por DLS é inviável, o tempo de análise e a incerteza do tamanho são absurdamente grandes. O limite prático real da técnica DLS é um D50 (ou modo) em torno de 1 µm.
É possível medir D50 = 2 µm – a preparação da amostra (concentração e contaminação) tem de ser muito bem controlada e o tempo de integração mais longo.
D50 = 3 µm, ainda possível, mas pouco viável como rotina.
D50 > 3 µm – o vendedor diz que faz? Exija uma demonstração ao vivo com a sua amostra. Talvez seja possível, mas qual a resolução?
Se sua distribuição tiver D50 acima de 1 µm, esse não é um trabalho para DLS.
Resolução de tamanho
DLS é ideal para populações monodispersas, ou seja, com tamanho bastante homogêneo.
Para distribuições bimodais ou multimodais, a diferença de tamanho entre os vários modos tem de ser de pelo menos 3X para ser possível uma separação adequada.
Para distribuições mais complexas, recomendamos o SLS acoplado a um GPC ou HPLC.
As especificações dos fabricantes de equipamento são para partículas de látex de 100 nm, em diluição adequada.
Concentração:
A equação de Einstein-Stokes é válida para diluição infinita. Ela pressupões que o sinal detetado seja resultante de uma única interação com uma partícula. À medida que aumenta a concentração de partículas na suspensão (ou emulsão), aumenta a probabilidade de que um fóton interaja com duas ou mais partículas (Espalhamento múltiplo). A presença de espalhamento múltiplo acarreta erro no diâmetro reportado, tanto maior, quanto maior a concentração. A concentração ótima para DLS é em geral entre 0,01% e 0,1% em volume.
Alguns fabricantes alegam medir diâmetros em concentrações tão altas quanto 40%. Em nenhum lugar explicam qual a “mágica” utilizada nem a exatidão dos resultados. Talvez possível em algumas amostras, com precisão altamente degradada. Faz sentido uma medida com um erro de 100%? Para a maior parte dos materiais, o limite máximo de concentração é muito mais baixo, entre 1% e 5%, e já com degradação significativa de exatidão.
Se você quer medir em alta concentração ou sua amostra não pode ser diluída sem alterar suas características e o aspecto da suspensão for minimamente turvo, é necessário usar uma variante mais elaborada da técnica DLS, que deteta e elimina espalhamentos múltiplos. Nenhum dos fabricantes mais conhecidos implementa essa técnica, que exige uma óptica bem mais complexa e cara. O NanoLab 3D é o único produto disponível que oferece essa técnica
Veja mais em Correlação Cruzada 3D. – Concentrações extremamente baixas podem apresentar outros problemas, em especial para partículas maiores
Ângulo de medição
Existem três alternativas mais usadas de ângulo de medição, cada uma com vantagens e desvantagens.
Como se comporta espacialmente o espalhamento de luz em função do diâmetro das partículas?
Note que a escalados gráficos é logarítmica, não linear, cada divisão é um fator de 10 de intensidade
D < 50 nm – Equação de Rayleigh – o espalhamento tem intensidade praticamente idêntica em todas as direções. Basta conhecer a viscosidade e temperatura do meio.
50 nm < D < 250 nm – uma região mais complicada, de transição. Em 240 nm, a intensidade a 0° é 40 vezes maior que a 180°.
D > 250 nm. Espalhamento Mie. Quanto maior o diâmetro, maior a intensidade a 0°, menor a intensidade a 180°. A diferença pode ser de centenas ou milhares de vezes.
Além disso, para cálculo preciso do tamanho, é necessário considerar indice de refração complexo da partícula e sua forma.
Não existe a alternativa “ correta”. Existe a alternativa mais adequada ao que você precisa saber.
O aparelho “ideal” deve ter os três ângulos, para o usuário ter a liberdade de escolher a opção mais adequada a cada caso.
- Deteção a 180° (na prática em geral 173°) – privilegia as partículas < 50 nm.
- Deteção a 90° – apresenta um equilíbrio entre partículas menores e maiores.
- Deteção a 0° (na prática em geral 15°) – privilegia as partículas > 250 nm, pode ser útil para deteção de agregados.
Se o seu interesse é em proteínas ou outras partículas menores que 10 nm, o espalhamento a 173° é o mais adequado.
Se sua amostra for monodispersa, não faz diferença o ângulo. O resultado é o mesmo, pode variar o tempo necessário para obter um bom resultado.
Se sua amostra for uma mistura de partículas pequenas (< 50 nm) com partículas acima de 100 nm, o ângulo de 90° em geral dá um valor mais “equilibrado” que o ângulo de 173°, que subestima as partículas maiores.
Se sua amostra for de pequeno diâmetro e você quiser saber se há agregados, eventualmente medidas em múltiplos ângulos dão maiores informações. Maiores detalhes em Guide to Making Useful Measurements of Monoclonal Antibodies (mAbs) with Dynamic Light Scattering .
Não pretendo aqui entrar em detalhes das teorias de Mie e Rayleigh ou equação de Einstein-Stokes.
Se alguém quiser saber mais, existem várias referências online. Por exemplo: https://pt.wikipedia.org/wiki/Espalhamento_dinâmico_de_luz
Para quem estiver interessado em conhecer a teoria mais a fundo, recomendo: “Let There Be Light: Characterizing Physical Properties of Colloids, Nanoparticles, Polymers & Proteins”; Weiner, Bruce B.
